Embriogênese somática e potencial uso de marcadores moleculares embriogênicos em Byrsonima intermedia A. Juss. (murici-pequeno)

Abstract

A Byrsonima intermedia A. Juss., espécie do cerrado, é comumente conhecida por murici-pequeno, devido ao seu pequeno porte em comparação a outras espécies do gênero. É considerada uma espécie com grande potencial medicinal já com alguns trabalhos científicos comprobatórios, que apresenta grande dificuldade de propagação natural por apresentar baixa germinação, crescimento lento e dormência tegumentar. Neste contexto, técnicas de cultura de tecidos apresentam-se como alternativa a propagação sexuada, destacando-se o uso da embriogênese somática. Assim, objetivou-se neste estudo determinar um protocolo a e avaliar aspectos da expressão gênica associada ao processo de indução de embriogênese somática de murici-pequeno. Para a indução de calos a partir de folhas de plântulas germinadas in vitro, foram testados diferentes subcultivos (60 dias) e concentrações de diferentes citocininas (BAP, TDZ, ZEA e CIN) combinados com concentrações de ANA. Diferentes concentrações de ANA também foram avaliadas na indução de calos pró-embriogênicos. Para a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos, os calos pró- embriogênicos foram subcultivados em meio MS sem a adição de reguladores de crescimento. Os embriões somáticos originados foram inoculados em meio de maturação contendo diferentes concentrações de GA 3 e de ABA. A formação de embriões secundários, o controle da hiper-hidricidade, o efeito de diferentes concentrações de sacarose e meios de cultura, diferentes vedações e concentrações de ágar também foram avaliadas. As análises moleculares Foram realizadas em diferentes explantes (calos pró-embriogênicos e embriogênicos e embriões somáticos). Os resultados mostram que para a indução de embriões somáticos, o uso de cinetina juntamente com ANA apresentou formação de embriões somáticos no segundo (4,76 μM de CIN + 0,54 μM de ANA) e terceiro (5,17 μM de CIN + 10,54 μM de ANA) subcultivos. O uso de alta concentração de ANA (537,06 μM) favoreceu a formação de embriões somáticos. O uso de GA 3 na concentração de 28,87 μM favoreceu a formação de plântulas. O uso de tampas sem PVC e tampa comercial Biosama ® apresentaram melhores resultados para tubos de ensaio e para frascos, respectivamente. O meio de cultura WPM suplementado com 3% de sacarose e solidificado com 0,8% de ágar reduziu a hiper-hidricidade de embriões somáticos. Mesmo sendo observado amplificação de fragmentos para os genes AGL1, LEC1, SERK e BBM, não foi possível realizar a RT-qPCR devido a dificuldade de realizar o sequenciamento dos genes em virtude de tratar-se de planta nativa.

Byrsonima intermedia A. Juss., a Brazilian vegetation species, is commonly known as ‘murici-pequeno’, due to its small size compared to similar species. Evidence from previous studies shows the plant has great medicinal potential; though the plant has great difficulty in propagating naturally, due to its low germination, slow growth and tegumental dormancy. In this context, tissue culture techniques are presented as an alternative to sexual propagation, the use of somatic embryogenesis being of particular interest. Therefore, this study aimed to establish a protocol for, and analyze aspects of, the gene expression associated with the process of inducting somatic embryogenesis in murici- pequeno. For the induction of calluses from seedling leaves in vitro, different subcultures were tested (60 days) and concentrations of different cytokinins (BAP, TDZ, KIN and ZEA) combined with concentrations of NAA. Different concentrations of NAA were also analyzed in the induction of pro-embryogenic calluses. For the induction of embryogenic calli and somatic embryos, the pro- embryogenic calli were subcultured on MS area without adding growth regulators. The somatic embryos were inoculated in a maturation medium containing different concentrations of GA 3 and ABA. The formation of secondary embryos, the control of hyperhydricity, the effect of different sucrose concentrations and culture media, different agar seals and concentrations were also analyzed. Molecular analyses were performed on different explants (pro- embryogenic and embryogenic calluses and somatic embryos). The results show that for the induction of somatic embryos, the use of kinetin with NAA presented the formation of somatic embryos in the second (4.76 μM CIN + 0.54 μM NAA) and third (5.17 μM CIN + 10.54 μM NAA) subcultures. The use of high concentrations of NAA (537.06 μM) favored the formation of somatic embryos. The use of GA 3 in the concentration of 28.87 μM favored the formation of seedlings. The use of caps without PVC and Biosama ® caps presented better results for test tubes and vials, respectively. The WPM medium, supplemented with 3% of sucrose and solidified with 0.8% of agar, reduced the hyperhydricity of somatic embryos. Even by observing the amplified fragments of genes AGL1, LEC1, SERK and BBM, it was not possible to perform the RT- qPCR because of difficulties in carrying out gene sequencing; this due to murici- pequeno being a native plant.