Clonagem de promotores raiz-específicos de Eucalyptus grandis e validação em Nicotiana tabacum

Abstract

O gênero Eucalyptus apresenta-se como um dos mais cultivados no mundo com uma ampla gama de utilizações, como matéria prima para fabricação de papel e celulose, móveis, estruturas para construção civil, carvão vegetal entre outras. A produção de plantas geneticamente modificadas com características específicas é um processo altamente promissor para o melhoramento genético das espécies de eucalipto. Pesquisas sobre o uso de promotores tecido-específicos são importantes, uma vez que esses direcionam a expressão de transgenes apenas nos órgãos/tecidos de interesse. Dessa forma, evitam a expressão generalizada em toda a planta, que, além do elevado custo energético, pode causar efeitos fenotípicos indesejáveis. O objetivo deste trabalho foi a clonagem de promotores raiz- específicos de Eucalyptus grandis e validação em Nicotiana tabacum, visando seu uso em construções gênicas para geração de plantas transgênicas tolerantes a estresses abióticos. Dois genes com expressão preferencial em raiz, Eucgr.G02172 e Eucgr.C00918, foram selecionados a partir de uma biblioteca de cDNA de raiz, caule e folha de diferentes genótipos de E. grandis e 1 kb da região promotora foi amplificado a partir do DNA de folha. As regiões amplificadas foram purificadas e clonadas em plasmídeo pGEM-T Easy (Promega). Após essa etapa, o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição EcoRI e BglII para liberar a região promotora, sendo essa posteriormente inserida no pCAMBIA 1303, vetor binário de transformação de planta que contém os genes marcadores gus e gfp fusionados. Os vetores contendo os promotores específicos de raiz foram utilizados para transformação de N. tabacum via Agrobacterium tumefaciens para validação da tecido-especificidade dos promotores isolados. Foi possível realizar a clonagem dos promotores específicos de raiz de E. grandis no vetor binário pCAMBIA 1303, permitindo que essa construção seja utilizada para transformação de outras espécies. Obteve-se eventos de N. tabacum transformados com promotor específico de raiz do gene Eucgr.G02172 e análises histoquímicas indicaram a expressão do promotor isolado em tecidos vasculares de raízes e folhas de tabaco.

Eucalyptus genus is one of the most cultivated in the world with a wide range of uses such as feedstock for the manufacture of pulp and paper, furniture, structures for building construction, charcoal and others. The production of genetically modified plants with specific characteristics is highly promising for genetic breeding of these species. Researches about the use of tissue-specific promoters are important, since these direct the transgene expression only in the interested tissue or organ. Therefore, it avoids the generalized expression in the whole plant, which, besides the high energy cost, can cause undesirable phenotypic effects. The objective of this work was to clone root-specific eucalyptus promoters, seeking to use it in gene constructs to generate transgenic plants tolerant to abiotic stresses. Two genes with preferential expression in root, Eucgr.G02172 and Eucgr.C00918, were selected from root, stem and leaves of a cDNA library of different genotypes of E. grandis and 1 kb of the promoter region was amplified from DNA leaf. The amplified regions were purified and cloned in pGEM-T Easy plasmid (Promega). After this step, the plasmid was digested with EcoRI and BglII to release the promoter region, and later inserted in the pCAMBIA 1303 binary vector containing the fused marker genes gus and gfp. The vectors containing the root-specific promoters were used for transformation of Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens to validate the tissue-specificity of isolated promoters. It was possible to clone the root-specific promoters of E. grandis in the pCAMBIA 1303 binary vector, allowing the use of this construct for transformation of other species. Transformed events of N. tabacum with the root- specific promoter of the gene Eucgr.G02172 were obtained and histochemical analyzes indicated the expression of the isolated promoter in vascular tissue of roots and leaves of tobacco.