Organogênese in vitro e transformação genética de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla via Agrobacterium tumefaciens

Abstract

Eucalyptus grandis x E. urophylla se destaca em plantios brasileiros devido às características que herdou de seus parentais, como qualidade da madeira para a produção de papel e celulose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de organogênese indireta com explantes foliares e aperfeiçoar aspectos da transformação genética mediante co-cultura com Agrobacterium tumefaciens. Para estabelecer o protocolo de organogênese indireta, na fase de calogênese, testaram-se diferentes concentrações de ANA e, em seguida, de TDZ combinado com ANA ou com 2,4-D no meio de cultura JADS por 30 dias, seguido de subcultura em meio de regeneração, contendo 5,0 μM de BAP e 0,5 μM de ANA por mais 30 dias. Nesses meios, os explantes tiveram alta oxidação. A fim de diminuir a oxidação, diferentes meios de cultura foram comparados: WPM, MS, JADS e QL. Obteve-se a maior porcentagem de regeneração e menor taxa de oxidação após cultura em meio WPM seguido de transferência a meio de regeneração. Assim, testaram-se ANA e 2,4-D combinado com TDZ, e em seguida, TDZ e BAP combinado com ANA no meio de cultura WPM. O tratamento mais eficiente em termos de regeneração de gemas foi o meio de cultura WPM e a combinação de 0,25 μM de TDZ e 0,1 μM de ANA por 30 dias para a calogênese e, em seguida, 5,0 μM de BAP e de 0,5μM de ANA por outros 30 dias. Este protocolo proporcionou uma regeneração de brotos de até 46%, com uma baixa oxidação dos tecidos. Observou-se que a idade das brotações utilizadas como fonte de explantes não tinha efeito sobre a organogênese e que pode-se utilizar explantes de 3, 4 ou 5 semanas na última subcultura. Para determinar as concentrações dos agentes seletivos que seriam utilizadas durante a transformação genética, testaram-se diferentes concentrações de canamicina, glufosinato de amônio e manose combinada com sacarose. Os resultados mostraram que se deve iniciar a seleção das plantas transformadas com o gene nptII em 12,5 mg L -1 de canamicina; para plantas transformadas com o gene bar em 0,5 mg L -1 de glufosinato de amônio; para plantas transformadas com o gene pmi em 22,5 g de sacarose e 7,5 g de manose. Experimento visando testar Augmentin ® e cefotaxima na eliminação de Agrobacterium tumefaciens também foi realizado. Na presença de Augmentin, os explantes formaram calos brancos e não oxidados, enquanto que, na presença de cefotaxima, os calos oxidaram. Para diminuir a oxidação imediata dos explantes transformados com o gene bar, esses foram deixados um mês sem glufosinato de amônio após a co-cultura, enquanto que no controle os explantes ficaram em meio de cultura com o agente seletivo. Neste experimento, todos os explantes do controle oxidaram e necrosaram, não formando calos, enquanto que os explantes que foram mantidos um mês sem glufosinato de amônio formaram calos. No entanto não houve regeneração de gemas o que impediu avaliar a eficiência da transformação genética. Além da transformação de explantes foliares com o gene bar, realizou-se transformação com o gene nptII, a qual originou brotações resistentes a 50 mg L -1 de canamicina.

Eucalyptus grandis x E. urophylla stands out in plantations in Brazil due to the characteristics it inherited from its parents, such as wood quality for pulp and paper production. The aim of this study was to develop a protocol for indirect organogenesis in leaf explants and improve aspects of genetic transformation by co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens. To establish the protocol for indirect organogenesis, during callogenesis stage, several concentrations of NAA and then NAA or 2,4-D combined with TDZ were tested in JADS culture medium for 30 days, followed by subculture of the explants on the regeneration medium, supplemented with 5,0 μM BAP and 0,5 μM NAA for another 30 days. In these media, the explants oxidation rate was high. Thus, in order to reduce oxidation, different culture media were compared: WPM, MS, JADS and QL, followed by transfer of the explants on regeneration medium. The highest percentage of regeneration and the lowest oxidation rate were obtained on WPM. Thus, we tested NAA and 2,4-D in combination with TDZ and then TDZ and BAP combined with NAA in WPM medium. The most efficient treatment in terms of bud and shoot regeneration was WPM and the combination of 0.25 μM TDZ and 0.1μM NAA during 30 days for callus induction and then 5.0 μM BAP and 0.5 μM NAA for another 30 days. This protocol yielded a regeneration rate of 46%, with a low oxidation of tissues. We also sought to know if the culture time in the last subculture of shoots source of explants affected organogenesis. The result was that the subcultures of 3, 4 or 5 weeks had no influence on organogenesis process. To determine the concentrations of selective agents that would be used in genetic transformation, we tested three concentrations of kanamycin, glufosinate ammonium and mannose combined with sucrose. The results showed that nptII transformed plants may be selected in 12.5 mg L -1 kanamycin supplemented medium. For plants transformed with the bar gene 0.5 mg L -1 glufosinate ammonium is adequate and plant transformed with the pmi gene may be selected in a medium containing 22.5g sucrose and 7.5 g mannose. Experiment aimed at testing Augmentin ® and cefotaxime in eliminating Agrobacterium tumefaciens was also performed. The antibiotic Augmentin provides explants with white and not oxidized callus, while callus oxidized in the presence of cefotaxime. To lessen the immediate oxidation of explants transformed with the bar gene, the explants were left one month without glufosinate ammonium after co-culture, while the control explants were cultured on a medium containing the selective agent. In this experiment, all explants on control medium oxidized, without forming callus, while the explants that were maintained one month without glufosinate ammonium formed calluses. However there was no regeneration of buds what impeded the evaluation of the efficiency of genetic transformation. In addition to transformation of leaf explants with the bar gene, transformation was also done with the nptII gene, which originated shoots resistant to 50 mg L -1 kanamycin.