Estresse oxidativo e transição de permeabilidade mitocondrial em células embriogênicas somáticas de Araucaria angustifolia estressadas pelo frio

Abstract

A Araucaria angustifolia é classificada como criticamente em perigo de extinção pela União internacional de conservação da natureza (IUCN) lista vermelha de espécies ameaçadas. O desenvolvimento e propagação desta espécie são influenciados por situações de estresse abiótico, como a variação de temperatura. Estudos anteriores evidenciaram a ativação da proteína desacopladora de mitocôndrias de plantas (PUMP) em células embriogênicas de A. angustifolia submetidas ao estresse pelo frio, um efeito associado ao estresse oxidativo. No presente estudo, buscou-se avançar no conhecimento da resposta desta conífera ao estresse pelo frio, com enfoque particular no estresse oxidativo. Desta forma, células embriogênicas de A. angustifolia foram submetidas ao estresse pelo frio (4 ± 1 ° C por 24h ou 48h) e foram avaliados a viabilidade e morfologia celulares, os níveis de H2O2, a lipoperoxidação e a atividade de enzimas antioxidantes. Em mitocôndrias isoladas destas células foram determinadas a atividade das NAD(P)H desidrogenases alternativas e a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). O estresse causado pelo frio não foi capaz afetar a morfologia e a viabilidade das células embriogênicas de A. angustifolia, no entanto, promoveu o aumento dos níveis de H2O2 em ~ 35% (em 24 e 48h). A lipoperoxidação também foi aumentada em ~ 15% e 30% após 24h e 48h de stress, respectivamente. A atividade da catalase foi reduzida em cerca de 20% após 48h de estresse, enquanto a ascorbato peroxidase (APx) e a dehidroascorbato redutase (DHAR) tiveram suas atividades aumentadas em ~ 100% e ~ 64%, respectivamente. Somente a atividade da monodehidroascorbate redutase (MDHAR) foi aumentada (~172%) no menor tempo de estresse (24h). As atividades das enzimas Glutationa redutase (GR) e superóxido oxidase (SOD) não foram alteradas pelas condições de estresse. Nas mitocôndrias, o estresse induzido pelo frio promoveu uma inibição significativa das NAD(P)H desidrogenases alternativas externas (~40% em 24 horas do stress e ~ 65% em 48 horas do stress), enquanto a transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) foi discretamente inibida (em 24h e 48h de stress). Estes resultados mostram que o estresse por baixa temperatura foi capaz de induzir o estresse oxidativo nas células embriogênicas de A. angustifolia, o que resultou na ativação das enzimas antioxidantes, em especial as do ciclo glutationa-ascorbato. Esta ativação parece compensar a inibição da catalase e das NAD(P)H desidrogenases externas, uma vez que a viabilidade e morfologia das células não foram alteradas. Este estudo contribui para o esclarecimento da resposta desta gimnosperma a condição de estresse por baixa temperatura e, assim, também para o desenvolvimento de métodos de conservação desta espécie, como a micropropagação in vitro.

Araucaria angustifolia is listed as critically endangered by International Union for Conservation of Nature (IUCN) red list of threatened species. The development and propagation of this species is strongly affected by abiotic stress, such as the temperature variation. We previously shown the activation of plant uncoupling mitochondrial protein (PUMP) in embryogenic A. angustifolia cells submitted to cold stress, an effect associated to oxidative stress. In this work, we advanced in these studies by submitting these cells to cold stress (4 ± 1°C for 24h or 48h) and evaluating the cellular and mitochondrial response associated to oxidative stress, namely: the H2O2 levels, the activity of antioxidant enzymes and lipid peroxidation. In mitochondria from these cells were evaluated the activity of NAD(P)H alternative dehydrogenases and mitochondrial permeability transition (MPT). The cold stress did not affect the morphology and viability of embryogenic A. angustifolia cells; however, increased the H2O2 levels by ~35% (at 24h and 48h) and lipid peroxidation by ~15% and 30% after 24h and 48h of stress, respectively. The activity of catalase was decreased by ~20% after 48h of cold stress while ascorbate peroxidase (APx) and dehydroascorbate redutase (DHAR) activities were increased by ~100% and ~64%, respectively. For the cells exposition to cold stress by 24h only dehydroascorbate redutase (MDHAR) had the activity increased by ~172%. Glutathione reductase (GR) and superoxide dismutase activities remained unchanged under both stress conditions. In mitochondria, the cold stress promoted a significant inhibition of external alternative NAD(P)H dehydrogenases (~40% at 24h of stress and ~65% at 48h of stress) while the mitochondrial permeability transition (MPT) was slightly inhibited in both, 24h and 48h of stress. The cold stress induces the oxidative stress in embryogenic A. angustifolia cells, which result in up-regulation of the enzymatic defense mainly the activation of gluthatione-ascorbate cycle in a compensatory way to the inhibition of catalase and external NAD(P)H dehydrogenases. These results contribute to understanding the pathway to overcoming the cold in this gymnosperm and are important for the development of conservation methods of this species such as in vitro micropropagation.