Caracterização de funções mitocondriais em Araucaria angustifolia

Abstract

Mitocôndrias de células embriogênicas de A. angustifolia contêm na sua membrana interna a cadeia transportadora de elétrons, bombeadora de H+ e produtora de ATP e também uma oxidase alternativa (AOX), não bombeadora de H+, insensível a cianeto e sensível ao SHAM. Possuem outros componentes alternativos como as NADH desidrogenases alternativas, que são sensíveis a flavona, uma oxidase alternativa (AOX) e uma proteína desacopladora de mitocôndrias de plantas (PUMP) identificada neste trabalho, pela primeira vez, em gimnospermas. Mitocôndrias de A. angustifolia foram capazes de respirar pela oxidação dos substratos malato/glutamato e succinato, com alta capacidade fosforilativa, demonstrada pelos controles respiratórios. Estas mitocôndrias também oxidaram o NADH externamente adicionado na presença e na ausência de rotenona. Malato/glutamato foram oxidados na presença de rotenona, evidenciando a presença da NADH desidrogenase interna. A adição de flavona a mitocôndrias respirando na presença de FCCP, causou inibição de 60% em ambas as desidrogenases alternativas. O complexo I e a succinato oxidase foram inibidos em 10-15% e 20%, respectivamente. O grau de inibição pela flavona nas atividades de NADH desidrogenase e NADH citocromo c redutase em mitocôndrias rompidas, também sugere o envolvimento das NADH desidrogenases alternativas. Além disso, a flavona causou uma significativa queda no potencial de membrana em mitocôndrias energizadas por NADH ou malato/glutamato. Mitocôndrias de células embriogênicas de A. angustifolia tratadas pelo frio e pelo calor, foram isoladas com o intuito de compará-las com mitocôndrias não submetidas a estresse. Através de análises por western blot foi possível identificar a proteína PUMP nas mitocôndrias de A. angustifolia submetidas ao estresse pelo frio e pelo calor. Foi utilizando o anticorpo policlonal de Arabidopsis thaliana (AtPUMP), o qual tem sido utilizado na identificação da PUMP de diferentes espécies de plantas, como do tubérculo de batata e tomate. A PUMP foi visualizada em uma única banda com peso molecular maior que 33 kDa. Células expostas a uma temperatura de 4°C por 48h tiveram aumento da expressão da PUMP quando comparadas com as mitocôndrias de células não submetidas a estresse. Já o efeito da exposição a 43°C por 4h parece ter sido muito drástico, pois desapareceu a banda da PUMP. A atividade da PUMP foi avaliada pela adição de BSA aos meios de isolamento e/ou de reação. Os valores de controle respiratório mostraram que o BSA previne o desacoplamento em todas as condições de estresse, indicando sua ação inibitória sobre a PUMP. Nos estudos comparativos da morfologia das células embriogênicas da A. angustifolia submetidas ou não a estresses por variação de temperatura, observou-se que o estresse pelo frio ou pelo calor foram danosos à morfologia tanto das células embrionárias como das suspensoras, interferindo na multiplicação celular, levando a uma diminuição no número de células e ocasionando deformações nas células suspensoras.

Mitochondria, containing in the inner membrane the proton-pumping respiratory chain that transfers electrons via cytochromes and synthesizes ATP, were isolated from embryogenic cells of A angustifolia. The membrane also includes a second pathway characteristically inhibited by salicylhydroxamic acid (SHAM), insensitive to cyanide, non-proton pumping and called alternative oxidase (AOX). Other characterized alternative components are the alternative NADH dehydrogenases, that were sensitive to flavone and, the plant uncoupling mitochondrial protein (PUMP) that was identified for the first time in gymnosperms. Mitochondria from A. angustifolia respired by oxygen consumption through the oxidation of the substrates malate/glutamate and succinate. They were highly functional, showing high phosphorylation capacity, demonstrated by the respiratory controls values. The external rotenone-insensitive NADH dehydrogenase was characterized through oxidation of externally added NADH in the absence or presence of rotenone. Internal NADH dehydrogenase was characterized by the oxidation of malate/glutamate in the presence of rotenone. The external and internal NADH dehydrogenases were inhibited at 60% by the addition of flavone to mitochondria respiring in the presence of FCCP. Complex I and succinate oxidase were inhibited at 10-15% and 20%, respectively. The inhibition of the alternative NADH dehydrogenases by flavone was also suggested through its effect on NADH dehydrogenase and NADH cytochrome c reductase in disrupted mitochondria. Flavone also caused a significant depolarization of the inner membrane in mitochondria energized by NADH ou malate/glutamate oxidation. Mitochondria were isolated from embryogenic cells of A. angustiofolia that had been submitted to temperature changes (cold or heat) and compared to untreated. The PUMP protein was identified in mitochondria from A. angustifolia through Western blotting and using this assay we also identified the differences on the protein expression respective to the treated and untreated cells. Polyclonal antibodies for Arabidopsis thaliana (AtPUMP) that already are used in the identification of PUMP from several plant species such as potato and tomato, were used in this assay. PUMP protein was visualized as a protein with a molecular mass higher than 33 kDa. Cells exposed at 4°C for 48h increased the expression of PUMP when compared to the unstressed. When cells were exposed to 43°C for 4h the effect seemed to be too severe and caused the disappearance of the protein band. The activity of PUMP protein was evaluated through the addition of BSA to the isolation and/or reaction medium. The values for the respiratory control ratio showed that BSA prevents uncoupling at all stress conditions indicating its inhibitory action on PUMP. Studies concerning the morphology of the embryogenic cells submitted or not to temperature changes showed that cold or heat caused damage to the embryonic and suspensor cells interfering in the cell multiplication with decrease in the quantity and causing deformation of the suspensor cells.