Construção e triagem de uma biblioteca metagenômica de solo da Floresta Atlântica Paranaense

Abstract

Técnicas padrões de microbiologia permitem identificar 1% ou menos da diversidade bacteriana na maioria das amostras ambientais. O volume de informações para a ecologia microbiana e o potencial biotecnológico presente na população microbiana, Domínios Bacteria e Archaea, ainda não cultivada, é estimado como sendo extremamente elevado. Para transpor as dificuldades e limitações associadas com as técnicas de cultivo tradicionais, vários métodos moleculares têm sido desenvolvidos para acessar diretamente o genoma desses organismos e também esforços para cultivá-los sob condições de laboratório. Metagenômica é um novo campo de investigação que utiliza ferramentas da Biologia Molecular para investigar a ecologia procariótica global assim como para acessar o vasto potencial biotecnológico oculto no mundo procariótico. Basicamente, Metagenômica compreende isolamento do DNA ambiental total e a produção e triagem de bibliotecas (meta)genômicas. Dois tipos de análises têm sido usados para obter informações de bibliotecas metagenômicas: uma abordagem baseada na seqüência do inserto de DNA e outra baseada na função de seus produtos. Neste trabalho, uma biblioteca metagenômica com DNA isolado diretamente do solo da Floresta Atlântica paranaense foi construída em um vetor pUC19R e analisada preliminarmente. O tamanho médio dos insertos está entre 9-10 Kpb de DNA. Todos insertos foram parcialmente seqüenciados e seus genes identificados pela comparação com o banco de dados do NCBI através do programa Blastx. O filo Proteobacteria predominou com 56,5%, seguido pelo filo Actinobacteria com 10,8% das seqüências. Os resultados apresentaram diferenças quando comparados com uma biblioteca de 16S rDNA, construída da mesma amostra de solo. Dois representantes do Domínio Archaea foram encontrados na biblioteca metagenômica, contrastando com a biblioteca de 16S rDNA onde nenhum representante foi encontrado. O resultado do sequenciamento também indicou similaridade para Bacterias e Archaea com potencial biotecnológico. Uma triagem funcional foi realizada com os meios específicos para aminoácidos descarboxilase, quitinase e celulase. Em adição, uma triagem funcional para celulase foi realizada em uma biblioteca construída em vetor fosmídeo, contendo 34.560 clones com insertos de tamanho entre 35-40 Kpb de DNA.

Técnicas padrões de microbiologia permitem identificar 1% ou menos da diversidade bacteriana na maioria das amostras ambientais. O volume de informações para a ecologia microbiana e o potencial biotecnológico presente na população microbiana, Domínios Bacteria e Archaea, ainda não cultivada, é estimado como sendo extremamente elevado. Para transpor as dificuldades e limitações associadas com as técnicas de cultivo tradicionais, vários métodos moleculares têm sido desenvolvidos para acessar diretamente o genoma desses organismos e também esforços para cultivá-los sob condições de laboratório. Metagenômica é um novo campo de investigação que utiliza ferramentas da Biologia Molecular para investigar a ecologia procariótica global assim como para acessar o vasto potencial biotecnológico oculto no mundo procariótico. Basicamente, Metagenômica compreende isolamento do DNA ambiental total e a produção e triagem de bibliotecas (meta)genômicas. Dois tipos de análises têm sido usados para obter informações de bibliotecas metagenômicas: uma abordagem baseada na seqüência do inserto de DNA e outra baseada na função de seus produtos. Neste trabalho, uma biblioteca metagenômica com DNA isolado diretamente do solo da Floresta Atlântica paranaense foi construída em um vetor pUC19R e analisada preliminarmente. O tamanho médio dos insertos está entre 9-10 Kpb de DNA. Todos insertos foram parcialmente seqüenciados e seus genes identificados pela comparação com o banco de dados do NCBI através do programa Blastx. O filo Proteobacteria predominou com 56,5%, seguido pelo filo Actinobacteria com 10,8% das seqüências. Os resultados apresentaram diferenças quando comparados com uma biblioteca de 16S rDNA, construída da mesma amostra de solo. Dois representantes do Domínio Archaea foram encontrados na biblioteca metagenômica, contrastando com a biblioteca de 16S rDNA onde nenhum representante foi encontrado. O resultado do sequenciamento também indicou similaridade para Bacterias e Archaea com potencial biotecnológico. Uma triagem funcional foi realizada com os meios específicos para aminoácidos descarboxilase, quitinase e celulase. Em adição, uma triagem funcional para celulase foi realizada em uma biblioteca construída em vetor fosmídeo, contendo 34.560 clones com insertos de tamanho entre 35-40 Kpb de DNA.