Transformação genética de Eucalyptus grandis x E. urophylla com o gene gfp sob controle de promotores cbfs induzidos pelo frio

Abstract

O híbrido Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla tem se destacado em plantios, principalmente no Brasil, devido às propriedades da sua madeira, habilidade de enraizamento e resistência ao cancro, resultando em alta produtividade e grande potencial para indústrias de papel, celulose e fibras. Programas de melhoramento genético têm propiciado avanços na produtividade florestal, redução de custos e melhorias na qualidade dos produtos. Porém, existem novas tecnologias que permitem potencializar ainda mais estes ganhos obtidos nos programas de melhoramento genético. A técnica de transformação genética pode contribuir com a introdução de caracteres de interesse econômico, que possibilitam o aumento na produtividade, melhora na qualidade da madeira e resistência ao estresse. Para o desenvolvimento de um sistema de transformação genética de plantas, além do entendimento de fatores relacionados com o processo de transformação, é fundamental um sistema de regeneração in vitro eficiente. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo geral a transformação genética de explantes foliares de E. grandis x E. urophylla via Agrobacterium tumefaciens, com o gene gfp sob controle dos promotores cbf1a e cbf1b. O trabalho foi dividido em três etapas. A primeira parte visou o estudo de alguns fatores que influenciam a regeneração de explantes foliares. O clone 11 apresentou capacidade regenerativa superior à do clone 827. A regeneração foi superior nos explantes foliares coletados de brotações repicadas a cada 17 dias em comparação com as repicadas a cada 26 ou 35 dias, com a utilização da parte basal da folha e com o aumento da frequência de repicagem dos explantes foliares em meio BIT. Na segunda parte foram analisados alguns fatores para otimização da transformação genética em E. grandis x E. urophylla. As condições que mostraram -se mais eficientes na transformação genética foram dois dias de pré-cultura, três dias de co-cultura e a adição da acetosiringona (50 μM) nos meios de pré e co-cultura. A terceira etapa teve como objetivo a introdução do gene gfp sob regulação dos promotores cbf1a ou cbf1b e a verificação de qual o melhor tempo de exposição dos explantes transformados a temperaturas baixas, visando à indução dos promotores estresse-induzidos cbf1a ou cbf1b. Para isto foram testados diferentes tempos de exposição dos explantes a 0 e 4 oC. A comprovação da expressão do gene da gfp sob regulação dos promotores cbf1a ou cbf1b induzidos pelo frio foi realizada por meio da técnica de RT-PCR em tempo real.

Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla hybrid has been largely used in planting, specially in Brazil, due to its wood proprieties, rooting habilities and tumor resistance that result in high levels of productivity and of performance for paper, cellulose and fibers industries. Breeding programs propiciated some advance in reforestation, reducing costs and guaranteeing the quality of the products. New technologies can potencialize gains of these programs. Genetic transformation techniques contribute to introduce genes that promote economic profits like more productivity and quality of wood or stress tolerance. Understanding the process and creating an efficient in vitro regeneration system are necessary steps to improve genetic transformation. This study aims at stablishing genetic transformation of leaf explants of E. grandis x E. urophylla via of Agrobacterium tumefaciens, with the gfp gene under control of promoters cbf1a and cbf1b. It consisted of three stages. First some characteristics that affect explants regeneration were studied. The clone 11 presented a higher regenerative capacity than 827. The regeneration was superior with leaf explants collected from shoots transferred each 17 days, compared with the shoots transferred each 26 or 35 days, by using basal section of the leaf and the increase of the frequency of transfer of the leaf explants on BIT medium. The second part some elements of otimization of E. grandis x E. urophylla genetic transformation were analyzed. The most efficient conditions during genetic transformation were two days of pre-culture and three days of co-culture and the use of acetosyringone (50 μM) in pre and co-culture media. Finally, gfp gene was introduced under cbf1 or cbf1b regulation in order to verify the most indicated duration of explants exposition at low temperatures and induce cbf1a ou cbf1b stress-induced promotors. Different intervals of time exposition at 0 oC and 4 oC were tested. gfp gene expression under cbf1a or cbf1b induced by cold was demonstrated by RT-PCR technique.