Prospecção metagenômica de biocatalisadores da microbiota de solos da Floresta Atlântica Paranaense

Abstract

A diversidade bacteriana do solo e seu potencial biotecnológico são pouco explorados. Dados indicam que 1 g de solo contém mais de 10 bilhões de micro-organismos distribuídos em milhares de espécies. Entretanto, a grande maioria dessas espécies são desconhecidas devido a sua inabilidade de se multiplicar nos meios de cultivo tradicionalmente usados em laboratório. A Metagenômica tornou possível o acesso a essa vasta diversidade genética permitindo a análise direta do DNA de uma comunidade bacteriana e levando à descoberta de novos biocatalisadores. Nesse trabalho são descritas a construção de três bibliotecas metagenômicas, a prospecção por novos biocatalisadores e a caracterização de uma nova lipase identificada nessas bibliotecas. As bibliotecas foram construídas a partir de amostras de solo da Floresta Atlântica Paranaense coletadas em diferentes altitudes. O DNA das amostras de solo foi purificado, reparado e clonado no vetor pCC2FOS. Os fosmídeos recombinantes foram transformados na estirpe EPI300 de Escherichia coli gerando as bibliotecas metagenômicas MAF1, MAF2 e MAF3 com 34.560, 29.280 e 36.288 clones, respectivamente. Todos os clones foram analisados quanto à atividade triacil-hidrolásica em tributirina (315 clones positivos), tricaprilina (10 clones positivos) e trioleína (3 clones positivos). Os clones da biblioteca MAF1 também foram analisados quanto à atividade de protease (460 clones positivos) e atividade de amilase (4 clones positivos). O DNA inserto dos clones com atividade lipolítica MAF1LP001, MAF1LP018 e MAF1LP090 foram sequenciados, o que permitiu identificar 80 ORFs/genes. A lipase LP001ORF27 foi identificada como membro da família I das lipases e similaridade próxima à subfamília termofílica I.5. A enzima purificada apresenta atividade contra diferentes para-nitrofenil-monoacilesteres (pNP monoacilesteres) com atividade máxima (7 U/mg) contra pNP decanoato. LP001ORF27 apresentou atividade do pH 5,0 ao 11,0, com atividade ótima em pH 7,0 e não apresentou dependência de metais. A temperatura ótima de atividade ocorreu na faixa de 50-60ºC e a enzima apresentou ativação térmica de 80% após incubação por 1 hora a 50ºC. A lipase LP018ORF16 não apresentou similaridade com sequências de lipases conhecidas e a análise filogenética sugeriu que ela constitui uma nova família. Essa enzima também demonstrou dependência da proteína LP018ORF15, provavelmente uma chaperona, para atividade. LP090ORF24 foi identificada como membro da família I das lipases, próxima a subfamília I.2, e também apresenta similaridade com uma poli-hidroxialcanoato (PHA) depolimerase. Próximo a LP090ORF24 foi identificado um gene que codifica uma -amilase. Finalmente, a análise da sequência dessa proteína sugeriu que ela contém um domínio de ciclodextrina glicosiltansferase (CGTase). Os resultados obtidos nesse trabalho confirmam o potencial da Metagenômica para a descoberta de novas enzimas de importância biotecnológica.

The bacterial soil diversity and its biotechnological potential are poorly explored. Data indicated that 1 g of soil contain more than 10 billion microorganisms distributed in thousand of species. However, less than 1% of these species is known because of its inability to grow in traditional culture medium. Metagenomics has made possible to access the vast genetic resources hidden in uncultivable microorganisms genomes since it allows direct analysis of a whole bacterial community DNA and can lead to the discovery of new biocatalysts. This work describe the construction and screening for biocatalysts from three metagenomic libraries from Brazilian Atlantic Forest soil and the characterization of a new lipase. The libraries were constructed from soil samples collected at different altitude levels and with different bacterial community along the Graciosa Road. The total DNA of these samples was extracted, end-repaired and cloned in pCC2Fos fosmid. The recombinant fosmids were transformed into Escherichia coli EPI300 strain yielding the metagenomic libraries MAF1, MAF2 and MAF3 with 34,560, 29,208 and 36,192 clones. All clones were screened for lipase activity on tributyrin (315 positive clones), tricaprylin (10 positive clones) and triolein (3 positive clones). Clones from MAF1 library were also screened for protease activity (460 positive clones) and amylase activity (4 positive clones). The DNA insert of the triolein degrading clones MAF1LP001 and MAF1LP018 and tricaprylin degrading clone MAF1LP090 were sequenced. A total of 80 genes were identified. Lipase LP001ORF27 was identified as member of family I of lipases close to the thermophilic subfamily I.5. The purified enzyme presented activity in a broad range of substrates with the highest activity against p-Nitrophenyl decanoate. LP001ORF27 showed activity in pH from 5.0 to 11.0, with an optimum at 7.0, and any dependence of metal ions was observed for its activity. The optimum temperature was 50-60ºC and the enzyme had a thermal activation of 80% after 1 hour at 50ºC. Lipase LP018ORF16 showed no similarity with previous lipase sequence and phylogenic analysis suggested that it constitute a new family. This enzyme also showed dependence of LP018ORF15, probably a foldase, for its lipolytic activity. LP090ORF24 was identified as family I lipase near to subfamily I.2 and share sequence similarity with a poly-beta-hydroxyalkanoate (PHA) depolymerase enzyme. Near to LP090ORF24 was also identified a -amylase coding gene sequence. Finally, protein sequence analyses suggest that this enzyme has a cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) domain. The obtained results confirmed the potential of the metagenomic approach in the discover of new enzymes of biotechnological importance.