Ectomicorriza in vitro entre Hydnangium sp. e Eucalyptus grandis e análises de seqüências de genes de Hydnangium sp.

Abstract

Hydnangium sp. é um fungo basidiomiceto capaz de formar ectomicorriza com espécies de Eucalyptus. Os sistemas de micorrização in vitro vêm sendo largamente utilizados para estudar interações micorrízicas, tornando-se um sistema simples e reproduzível para as análises de expressão de genes envolvidos na interação. Neste trabalho, a técnica de micorrização in vitro para a interação do fungo Hydnangium sp. com E. grandis foi realizada para as fases de colonização, diferenciação e funcionamento da ectomicorriza. A fase de colonização foi verificada após cinco dias de inoculação com Hydnangium sp., a fase de diferenciação após 10 dias e a fase de funcionamento após 20 dias de inoculação. A morfologia externa foi analisada por lupa e foram avaliados cortes microscópicos para a detecção do manto e da rede de Hartig. A extração de RNA total foi realizada para cada uma das fases, com o objetivo de analisar a expressão gênica. Entretanto, a quantidade de material proveniente de raízes de 130 plântulas para cada fase, foi insuficiente para a detecção de transcritos por meio de RTPCR. A análise dos íntrons das seqüências parciais dos genes que codificam ATP sintase (atp) e acetil-CoA acetiltransferase (aat) de Hydnangium sp. permitiu a identificação de dois íntrons na seqüência parcial do gene atp (53 e 65 pb), enquanto que na seqüência parcial do gene aat foram identificados três íntrons (52, 52 e 46 pb). Todos os íntrons analisados possuem a seqüência padrão 5’ GT - 3’ AG no sítio de processamento, variando os nucleotídeos adjacentes. A análise filogenética, utilizando as seqüências parciais de aminoácidos deduzidas dos genes atp e aat, permitiu a separação correta dos grupos, corroborando a classificação do fungo Hydnangium sp. como pertencente à mesma família de Laccaria bicolor.

Hydnangium sp. is a basidiomycetous fungus that is capable of forming ectomycorrhiza with Eucalyptus species. The in vitro mycorrhization system is widely used for mycorrhizal interactions studies, becoming a simple and reproducible system for the symbiosis-regulated genes expression analysis. In this work, the in vitro mycorrhization system for the Hydnangium sp. and Eucalyptus grandis interaction was performed for the colonization, differentiation and functioning phases for the ectomicorriza formation. The colonization phase were verified after five days of inoculation with the Hydnangium sp., the differentiation phase after ten days and the functioning phase after 20 days of inoculation. The extern morphology was analyzed by stereomicroscopy and the section microscopy was performed for the mantle and Hartig net detection. The total RNA extraction was performed for each phase, with the objective of to analyze genes expression. However, the material quantity from roots of 130 seedlings for each phase was insufficient for the transcripts detection through RTPCR. The intron analysis of the partial sequences of the genes that encode ATP sintase (atp) and acetyl-CoA acetyltransferase (aat) of Hydnangium sp. enabled two introns identification in partial sequence of atp gene (53 and 65 bp), while in partial sequence of aat gene were identified three introns (52, 52 e 46 bp). All introns analyzed have the canonical sequence 5’ GT - 3’ AG on splicing sites, ranging the adjacent nucleotides. The phylogenetic analysis, using the partial sequences of amino acids of atp and aat genes, enabled the correct group separation, corroborating the Hydnangium sp. classification as belonging the same family of Laccaria bicolor.