Detecção e mapeamento de polimorfismo de sequência única em uma população segregante de Eucalyptus spp.

Abstract

O gênero Eucalyptus apresenta ampla variabilidade genética, relacionada a características economicamente importantes, passível de ser explorada pela integração de métodos clássicos de melhoramento genético e genômica. Apesar dos avanços obtidos pelo melhoramento genético, espécies de Eucalyptus ainda estão nos estágios iniciais de domesticação apresentando, portanto, ampla oportunidade de ganhos pela seleção direcional. O desenvolvimento de mapas genéticos de alta resolução, enriquecidos com informação de genes, é uma estratégia com possibilidades de impactar futuras aplicações de melhoramento molecular. No entanto, com exceção de organismos para os quais o genoma encontra-se sequenciado, as técnicas atuais para se localizar genes em um mapa-referência têm mostrado eficiência limitada. Recentemente foi demonstrado em organismos modelo que microarranjos de oligonucleotídeos desenvolvidos para estudos de expressão podem ser utilizados para a detecção de polimorfismos de sequência, gerando marcadores denominados polimorfismos de elementos individuais (SFP, do inglês Single Feature Polymorphisms). As sondas no microarranjo detectam sítios polimórficos de SNPs ou “indels” nas regiões expressas fornecendo marcadores específicos de genes que, ao demonstrarem comportamento mendeliano, podem ser mapeados. O objetivo deste trabalho foi aplicar o princípio de descoberta, genotipagem e mapeamento de SFPs em uma população segregante F1 de E. urophylla x E. grandis. SFPs foram detectados com sucesso utilizando microarranjos de oligonucleotídeos contendo sequências derivadas de genes únicos gerados a partir de sequências- consenso de ESTs de diferentes espécies de Eucalyptus. Visto que essa classe de marcadores representa regiões gênicas, mapeamento de SPFs se torna uma abordagem eficiente para mapeamento em larga escala de genes em organismos com genoma não sequenciado. O uso da estratégia de pseudo cruzamento teste permitiu a detecção de marcadores dominantes segregando 1:1 e 3:1 em uma amostra da população de mapeamento. Um mapa genético saturado foi gerado com 884 SFPs sobre um mapa de referência pré-existente de 180 microssatélites, atingindo uma densidade média de um marcador a cada 1,2 cM em 11 grupos de ligação. O uso de um delineamento experimental que permite a detecção de SFPs segregando 3:1, além de aumentar a densidade do mapa e o número de genes mapeados, possibilitou o aumento da qualidade do mapa final. Os resultados também demonstraram que aumentando-se o número de sondas testadas por gene aumenta-se a probabilidade de detectar SFPs no gene alvo e consequentemente de mapeá- lo. Este é o primeiro trabalho de desenvolvimento e mapeamento de SFPs em Eucalyptus. A possibilidade de mapear genes em larga escala de forma rápida e acessível permite a condução de análises de co-localização destes genes com QTLs, abrindo espaço para a descoberta de potenciais genes candidatos que controlam esses QTLs para futuramente serem testados em experimentos de genética de associação.

The genus Eucalyptus presents a broad natural genetic diversity for economically important traits that could be explored through an integration of classical breeding and genomic approaches. In despite of the advances obtained by classical breeding, species of Eucalyptus are still in the early stages of domestication and, therefore, present several opportunities of gain through forward selection. The development of high-resolution genetic maps enriched with gene information is a strategy that can possibly impact future molecular breeding applications. However, except for organisms where genome sequence information is available, current techniques to allocate genes on the reference map have shown limited efficiency. Recently, it has been demonstrated in model organisms that oligonucleotide microarrays developed to assay gene expression can be used to detect sequence polymorphisms, generating markers termed Single Feature Polymorphism (SFP). The probes of the microarray detect polymorphic loci containing SNPs or indels on expressed regions, creating gene-specific markers that can be mapped. The objective of this study was to apply the principle of SFP discovery, genotyping and mapping in a segregating F1 population of E. urophylla x E. grandis. SFPs were successfully detected using oligonucleotide microarrays with sequences of unigenes generated by sequencing ESTs from different species of Eucalyptus. Since this class of markers samples gene regions, SFP mapping becomes an efficient approach for large-scale gene mapping in organisms with unsequenced genomes. The use of pseudo-testcross strategy allowed the detection of dominant markers segregating 1:1 and 3:1 in a subset of the mapping population. A saturated gene-rich genetic map was generated with 884 SFPs on a previous reference map of 180 microsatellites, with an average density of one marker every 1.2 cM in 11 linkage groups. The use of an experimental design that enables SFPs segregating 3:1 to be detected not only increased map density and number of mapped genes but, more importantly, improved the overall quality of the final map. The results also demonstrated that increasing the number of probes designed per unigene resulted in a higher probability of SFP detection for the targeted gene and, thus, of ultimately mapping it. This is the first report of SFP detection and genotyping for Eucalyptus. The possibility to map genes in large-scale in a quick and inexpensive way allow for the conduction of co-localization analysis of these genes to QTLs, creating possibilities to discover potential candidate genes for these QTLs to be tested in association genetics experiments.