Estabelecimento, multiplicação, calogênese, organogênese in vitro e análise da diversidade genética em acessos de Eugenia involucrata DC

Abstract

A cerejeira (Eugenia involucrata DC.) é uma espécie florestal brasileira com diversas características de interesse econômico, especialmente nos setores de silvicultura, fruticultura, paisagístico, ambiental e medicinal. No entanto, possui sementes recalcitrantes, as quais começam a perder sua viabilidade após duas semanas de coleta. Além disso, não existem informações sobre a variabilidade genética desta espécie. Este trabalho objetivou desenvolver metodologias para o cultivo in vitro de E. involucrata e avaliar a variabilidade genética existente em acessos desta espécie mantidos in situ e ex situ. Na propagação por técnicas de cultura de tecidos, avaliou-se a desinfestação de explantes, bem como foram estudados aspectos de crescimento e desenvolvimento in vitro após a inoculação de segmentos apicais e nodais em diferentes meios nutritivos. Também foi avaliado o efeito de diferentes fitorreguladores na otimização da multiplicação in vitro. Para a calogênese in vitro, foram avaliados métodos de desinfestação superficial, formas de inoculação dos explantes, introdução de reguladores de crescimento, os efeitos de diferentes regimes luminosos, do uso de antioxidantes e de citocininas. Foi analisada a formação de calos sobre diversos aspectos de desenvolvimento. Testaram-se diferentes métodos para a extração de DNA genômico da espécie, utilizando-se diferentes tecidos vegetais. Realizou-se a análise de acessos oriundos de populações mantidas in situ e ex situ por meio do uso de marcadores RAPD. Como resultados, foi possível estabelecer cultivos assépticos da espécie, além disso, o estabelecimento in vitro pode ser realizado com segmentos apicais e nodais, no entanto, segmentos nodais oferecem os melhores resultados. O meio 1⁄2 MS é o mais adequado e auxilia na rizogênese, além de outros aspectos de desenvolvimento das plantas. A utilização de concentrações elevadas de TDZ associadas à ANA permite a multiplicação de brotos e o surgimento de gemas adventícias em segmentos nodais. GA3 não promove o alongamento dos brotos e, em concentrações elevadas, apresenta-se tóxico. Para a calogênese in vitro, a melhor forma de cultivo é mantendo-se o explante em posição abaxial e na ausência de luz. Combinações entre auxinas e citocininas produzem os melhores índices de calogênese. O emprego da associação 2,4-D e TDZ promove a melhor formação de calos e de calos candidatos à embriogênese. É possível extrair DNA de boa qualidade a partir de folhas e câmbios de cerejeira, utilizando-se a maceração com o tampão de extração concentrado a 10%. A análise com marcadores moleculares RAPD mostrou-se eficiente na estratificação da variabilidade genética de acessos de cerejeira. Observou-se que a variabilidade está bem distribuída entre os acessos nas diferentes populações in situ e que, a população ex situ avaliada, não possui variabilidade satisfatória. Foi possível gerar informações consistentes que poderão auxiliar o cultivo e o planejamento de programas de melhoramento da espécie.

The cerejeira-do-Rio-Grande (Eugenia involucrata DC.) is a Brazilian forest species with traits of economic interest, especially in the forestry, horticulture, landscape, environmental and medicinal sectors. However, it has recalcitrant seeds, which begin to lose viability after two weeks of gathering. Moreover, doesn’t known how its genetic variability is distributed. This study aimed to developed methodologies for in vitro culture of E. involucrata and evaluate the genetic variability in accessions maintained in situ and ex situ. In vitro propagation, besides desinfestation, we evaluated aspects of in vitro growth and development after the inoculation of the apical and nodal segments in different nutritive media. We also analyzed the effect of introduction of different growth regulators in the optimization of in vitro multiplication. For callus induction in vitro were evaluated methods of superficial desinfestation, ways of introduction of plant growth regulators, the effect of different light regimes, of the use of antioxidants and of the different cytokinins. The formation of callus on different aspects were evaluated. We tested different methods for extraction of genomic DNA from this specie using different plant tissues. We performed analysis of acess coming from populations maintained in situ and ex situ by the use of markers. It was possible to establish aseptic cultures of E. involucrate. The establishment in vitro can be accomplished with the apical and nodal segments, however, nodal segments offer the best results. The 1⁄2 MS is the most appropriate nutritive medium and helps in rooting. The use of high concentrations of TDZ associated with ANA enables shoot multiplication and the emergence of shoots from nodal segments. GA3 does not promote the elongation of shoots and is toxic in high concentrations. Callus formation was obtained in leaf discs of E. involucrata. The best way to grow is maintaining the explants in abaxial position and in the dark. Combinations of auxins and cytokinins generate the highest percentage of callus formation. The association of 2,4-D and TDZ promotes better callus formation and callus candidates to embyogeneis. It is possible to extract good quality genomic DNA from E. involucrata leaves and cambia, using the maceration with the extraction buffer concentrate to 10%. Analysis with molecular markers was efficient in the stratification of genetic variability in accessions of cherry. It was observed that the variability is evenly distributed between the accessions in different in situ populations and that in the ex situ population assessed the variability is not satisfactory. It was possible to generate consistent information to assist in the cultivation and in planning of breeding programs of the species.