Caracterização morfofisiológica, patogênica e molecular de isolados de Diplodia pinea

Abstract

Diplodia pinea é um patógeno que causa doença em vários gêneros de coníferas e perdas em plantações comerciais de Pinus devido à seca de ponteiros. D. pinea se reproduz apenas assexuadamente, sendo comum a presença de linhagens clonais (morfotipos A e C) apresentando diferenças no potencial de agressividade com relação ao hospedeiro. Diante da importância econômica do gênero Pinus para o Brasil e no potencial do D. pinea em causar danos nesse gênero, o objetivo deste estudo foi efetuar uma caracterização morfofisiológica, patogênica e molecular de 20 isolados de D. pinea obtidos das regiões Sul e Sudeste do Brasil. O aspecto micelial dos isolados foi avaliado em placas com meio BDA e EMA,a temperatura ótima de crescimento dos isolados, em meio BDA e a esporulação em meio APA, nas temperaturas de 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 °C. Foram avaliados 100 conídios por isolado quanto às dimensões, número de septos, espessura e aspecto da parede, sob microscópio ótico e eletrônico de varredura. Avaliou-se, também, a parede dos conídios quanto à presença de perfurações. A agressividade dos isolados foi avaliada em mudas de Pinus taeda e Pinus elliottii var. elliottii. A caracterização molecular dos isolados foi realizada através do sequenciamento da região ITS1--5,8S—ITS2 do rDNA. Os isolados apresentaram em meio BDA e EMA micélio algodoado inicialmente branco mudando-se para cinza chumbo. Os conídios avaliados apresentaram dimensões entre 30-39,9 x 12,9-16,5 μm de largura, principalmente sem septos ou uniseptados. A microscopia eletrônica revelou conídios com parede lisa e sem a presença de pontuações, típica para o morfotipo A. O crescimento dos isolados foi verificado de 12 a 36 °C e a formação de picnídios de 12 a 32 °C, mas os conídios maturos foram observados a 20, 24 e 28 °C. O isolado B11 foi o mais agressivo nas duas espécies de Pinus testadas e a existência de interação foi verificada entre isolados e espécies de Pinus. O sequenciamentoformou um clado monofilético agrupando os isolados de Diplodia pinea. Os resultados indicam que os isolados pertencem ao morfotipo A de D. pinea.

Diplodia pineais a known pathogen that causes disease in several genera of conifers and extensive losses in commercial plantations of Pinus due to tip blight. D. pinea only reproduce asexually, being common the presence of clonal lineages (A and C morphotypes) that differ in potential with respect to the host aggressiveness. Given the economic importance of the genus Pinus in Brazil and the ability of the pathogen to cause damage, the aim of this study was to perform detailed morphological, physiological, molecular and pathogenic of twenty D.pinea isolates obtained from Southern and Southeast regions of Brazil. Micelial appearance of isolates grown on PDA and EMA media, optimum temperature for growth on PDA medium and sporulation on APA medium, were evaluated at temperatures of 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 °C. Dimensions, number of septa, wall thickness and appearancewere evaluated in 100 conidia per isolate underlight microscope. It was also evaluated the wall of conidia by the presence of perforations. The aggressiveness of isolates was performed on seedlings of Pinus taeda and Pinus elliottii var. elliottii. Molecular characterization of the isolates was performed by sequencing the ITS1 - 5, 8S- ITS2 rDNA. Isolates showed cottony mycelium on PDA, initially white changing to dark gray. The conidia showed dimensions of30–39.9 x12.9–16.5μm, especially without septa or with one septa. The electron microscopy revealed conidia with smooth wall without the presence of pitty, typical for morphotype A.Growth of isolates was observed from 12 to 36 °C, and pycnidia were formed from 12 to 32 °C, but only mature conidia were observed in 20, 24 and 28 °C. B11 isolate was the most aggressive and interaction was verified between isolates and Pinus species. The sequencing formed a monophyletic clade grouping the Diplodia pinea isolates. Results indicate that isolates belong to morphotype A of D. pinea.