Organogênese indireta em Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii e transformação genética de Eucalyptus saligna e Nicotiana tabacum

Abstract

O melhoramento das espécies vegetais via transformação genética pode ser uma alternativa para minimizar os impactos negativos causados pelo meio ambiente. O híbrido Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii é um material promissor para tolerância ao frio e à geada. Contudo, ainda não há estudos relacionados à organogênese, etapa essencial para o desenvolvimento de protocolos eficientes de transformação. Diante disto, o primeiro capítulo desta tese teve como objetivo principal estudar alguns fatores importantes para a organogênese indireta a partir de tecido foliar e para a micropropagação desse híbrido. Foram avaliados diferentes reguladores vegetais e composições salinas dos meios de cultura. No segundo capítulo foram estudados fatores que podem afetar a transformação genética de explantes cotiledonares de Eucalyptus saligna mediante co-cultura com Agrobacterium tumefaciens, como a exposição dos explantes a uma solução antioxidante, a pré-cultura dos explantes, a influência de diferentes antibióticos na regeneração de gemas e a utilização da acetosiringona nos meios de co-cultura. No terceiro capítulo foram avaliados aspectos fisiológicos, morfológicos e anatômicos de plantas de Nicotiana tabacum transformadas com o gene p5csf129a. Foram realizadas avaliações morfológicas, quantificação do conteúdo de prolina, estudo da anatomia foliar e análise da germinação de sementes T1 sob diferentes temperaturas. Em relação ao híbrido estudado, foram obtidos resultados preliminares de organogênese e multiplicação, havendo baixa regeneração indireta de gemas em explantes foliares cultivados no meio MS contendo a metade da concentração de nitratos e adicionado de 0,1 μM ANA e 0,5 μM TDZ. Durante o processo de transformação de cotilédones de E. saligna, a utilização da solução antioxidante foi dispensável; a pré-cultura dos explantes antes da inoculação com A. tumefaciens não melhorou a taxa de regeneração; o antibiótico Augmentin ® favoreceu a organogênese em relação a cefotaxima; a concentração de canamicina interferiu na sobrevivência dos explantes mantidos em meio seletivo e apresentou efeito sobre a seleção do material transformado e, por fim, a adição da acetosiringona nos meios de co-cultura sólido e líquido teve influência positiva na eficiência da transformação dos explantes cotiledonares. Já as plantas de N. tabacum transformadas com o gene p5csf129a que apresentaram maior acúmulo de prolina, mostraram diferenças morfológicas nas folhas e flores; após a exposição à baixa temperatura, as sementes dos eventos transformados tiveram taxa de germinação superior em relação ao controle. As estruturas foliares analisadas não apresentaram diferenças qualitativas no que se refere a anatomia, porém, diferenças quantitativas foram percebidas, como o ângulo de inserção da nervura secundária com a primária diferente nas folhas das plantas com os maiores valores de prolina encontrados em comparação com o controle.

Plant breeding through genetic transformation can be an alternative way to minimize negative effects due to environment, through the insertion of genes that induce stress tolerance. Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii hybrid is a promising material for these studies due to its tolerance to cold and frost. However, there are no studies related to its organogenesis and micropropagation yet, what is fundamental to develop efficient transformation protocols. The main objective of the first chapter was to study some factors involved with indirect organogenesis in foliar tissue and micropropagation, such as plant growth regulators and saline content of the culture media. The second chapter aimed to study some of the factors that affect the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Eucalyptus saligna cotyledonary explants, suh as exposition of explants to antioxidant solution, preculture, influence of various antibiotics on bud regeneration and addition of acetosyringone to co-culture media. Finally the third chapter aimed to analyze the physiological, morphological and anatomical aspects of Nicotiana tabacum plants transformed with p5csf129a gene, through morphological evaluations, proline content quantification, study of leaf anatomy and T1 seeds germination study under different temperatures. Preliminary results about organogenesis of the hybrid indicated that bud indirect regeneration in foliar explants was low and only observed in MS N/2 medium supplemented with 0.1 μM NAA and 0.5 μM TDZ. In transformation process of E. saligna cotyledonary explants, the use of an antioxidant solution was not necessary; explants preculture before inoculation with A. tumefaciens; did not improve regeneration rates. Augmentin ® antibiotic favored organogenesis in relation to cefotaxime; kanamicyn concentration interfered with explant survival when maintained in a selective medium and presented effects on selection of transformed material, and finally, the addition of acetosyringone in solid and liquid co-culture media affected positively the transformation efficiency of cotyledonary explants. Plants of N. tabacum transformed with p5csf129a gene with the highest proline content presented morphological differences both in leaves and flowers. After exposition to low temperatures the seeds from transformed events had higher germination rate than the seeds from wild type plants. The leaf anatomy of the events did not present qualitative differences; however, quantitative differences were noticed, mainly regarding the secondary versus primary vein insertion angle, in leaves of the events with the highest quantities of proline when compared with wild plants.